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病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

(1)原理：很多病毒都有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的作用，尤以致癌病毒zui為明顯。EB病毒(EBV)是近年來(lái)常用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的病毒。該病毒對(duì)人二倍體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效果，常用于建立淋巴細(xì)胞永生細(xì)胞系。人外周血B淋巴細(xì)胞膜上有。EB病毒受體，當(dāng)EB病毒與受體結(jié)合后，B淋巴細(xì)胞可發(fā)生轉(zhuǎn)化，成為體外長(zhǎng)期傳代生長(zhǎng)的細(xì)胞系。

(2)材料

1)病毒：EB病毒液(取自培養(yǎng)的B95—8細(xì)胞)。

2)轉(zhuǎn)化細(xì)胞：檸檬酸或肝素抗凝人外周血。

3)細(xì)胞培養(yǎng)液：含20％胎牛血清的RPMI 1640。

4)抗生素：青霉素、鏈霉素和慶大霉素。

5)洗液：PBS。

(3)方法

1)血液制備：抗凝全血1～2ml，分裝于15ml離心管中，每管O．5ml，置于4℃冰箱中放置30min后，加入不含血清的RPMI1640離心洗一次，用含20％胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。

2)EB病毒的獲得：培養(yǎng)的B95—8細(xì)胞，10000r／min離心15min去除細(xì)胞碎片，再經(jīng)24000r／min，離心90min獲得病毒沉淀，以1：100體積培養(yǎng)液溶解獲得EB病毒濃縮液。

3)EB病毒轉(zhuǎn)化：加入EB病毒液，O．3～0．5ml／管，37℃水浴30min～2h，并不時(shí)搖動(dòng)，以利于病毒吸附和并防止血凝塊產(chǎn)生。

4)分裝入50ml培養(yǎng)瓶中，同時(shí)補(bǔ)加培養(yǎng)液，5ml／管，置入含5％CO2的37℃溫箱中培養(yǎng)。

5)細(xì)胞培養(yǎng)一周后再補(bǔ)入2ml培養(yǎng)基。

6)每3～4d加液或半量換液，隨細(xì)胞數(shù)量增多，可分裝人大瓶中培養(yǎng)。為了提高轉(zhuǎn)化效率，常將全血凍存復(fù)蘇后采用。

(4)結(jié)果觀察與鑒定：需每天鏡檢培養(yǎng)物，開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)，鏡下可見(jiàn)大量紅細(xì)胞，難以觀察到單核細(xì)胞。培養(yǎng)5～7d后，單個(gè)或成團(tuán)的淋巴細(xì)胞增殖迅速，成大團(tuán)塊，呈懸浮生長(zhǎng)，紅細(xì)胞已*消失，轉(zhuǎn)化完成。